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探索大豆异黄酮对实验性肺纤维化的影响

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发表于 2011-3-24 08:44:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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【前言】

1.1肺纤维化

肺纤维化pulmonary fibrosis,PLF是很多病因不同的肺间质疾病的共同结局。统计资料显示其5年生存率低于50%,l0年生存率约30% ,目前尚缺乏有效防治手段,因此防治肺纤维化有效药物的寻找,一直是国内外药物研究的热点。最近研究表明其病因形成与肺的反复损伤后的过度修复有关,表现为肺胶原代谢失衡,成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集[1],肺泡血管内皮细胞氧化受损,血管通透性增高,炎性细胞浸润肺间质,进而成纤维细胞被激活,可见血管内皮氧化损伤在肺纤维化形成过程中的重要环节。正常人体肺组织存在着氧化/抗氧化的平衡,肺泡上皮贴壁粘液含有维生素 CvitC)、谷胱甘肽、铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶等抗氧化物质,可对抗吸入的或炎症细胞释放的氧活性物质。纤维化性肺泡炎时,氧代谢活性产物的产生大量增加,使氧化/抗氧化物质失衡,造成肺组织的氧化损伤,促进肺纤维化的发生,故此,给予抗氧化治疗,对控制肺纤维化的发生具有一定作用。

1.2大豆异黄酮

大豆异黄酮Soy isoflavones SI是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物,由于能与雌激素受体结合,具有雌激素样用,故称之为植物激素,其系由大豆及黑豆等豆类植物中提炼而出,具有扩张血管,抗血小板聚集,降低纤维蛋白原,抑制血管内皮细胞增生等作用,能降低纤维蛋白原,抑制血管内皮细胞增生。

有研究表明大豆异黄酮具有广泛的生物学作用,其中雌激素样的明显的清除自由基和抗氧化作用受到广泛的关注。经研究表明,大豆异黄酮的抗氧化机制通过三条途径实现:1、清除自由基,发挥直接抗氧化功能 ;2、提高抗氧化酶系的活力,抑制脂质和脂蛋白的氧化,发挥间接抗氧化功能 ;3、诱导金属硫蛋白和影响其它氧化还原酶的表达,发挥其抗氧化功能

超氧化物歧化酶(SOD)脂质氧化终产物丙二醛(MDA)是抗氧化与氧化过程中的重要酶,可分解机体代谢过程中产生的活性氧如过氧化氢,超氧阴离子等,这些物质可对机体尤其是质膜产生毒害作用。SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶,也是生物体内重要的抗氧化酶,它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,复原因自由基造成的对细胞伤害。MDA在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性,是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化终产物,也就是膜脂受活性氧作用产生的物质

博莱霉素致鼠肺纤维化机制不清,已知自由基损伤是其重要机制,而自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸,发生脂质过氧化,产生MDA和过氧化脂质,因此检测MDA的量间接反映出细胞损伤的程度,继而可以评价质膜受损程度,同时测定SOD的活力可以评价机体受活性氧毒害程度。

羟脯氨酸(oxyproline hydroxyproline
Hyp)
是胶原蛋白的主要成份之一,约占其氨基酸总量的l3% ,其他除弹性蛋白含有少量羟脯氨酸外(约1%),均不含羟脯氨酸,因此组织中羟脯氨酸含量可作为其胶原组织代谢的重要指标,用于显示肺纤维化的程度。

国内较多动物实验和临床试验报道大豆异黄酮在心脑血管、肝脏和抗肿瘤治疗中的作用,但国内外尚未见到大豆异黄酮对肺纤维化作用的基础及临床报道。因此,本实验从大豆异黄酮抗氧化作用保护血管内皮细胞受损来探索其对肺纤维化不同时期的影响效果。希望能对临床上肺纤维化的预防及治疗有一定指导作用。

【实验内容】

2.1 研究内容

本组实验共设一个生理盐水空白对照组,一个模型对照组,三个不同浓度实验组,通过肺纤维化的程度以及肺组织中SODMDA含量的测定,来探究大豆异黄酮的抗氧化作用对肺纤维化的影响。

2.2 实验流程

实验大鼠(60只)
正常空白对照(12)
SI-M(12)
SI-L(12)
模型空白对照(12)
SI-H(12)
3d(3)
28(3)
14(3)
7d(3)
3d(3)
28(3)
14(3)
7d(3)
3d(3)
28(3)
14(3)
7d(3)
3d(3)
28(3)
14(3)
7d(3)
肺组织形态学观察
肺组织SOD含量测定
肺组织Hyp含量测定
肺组织MDA含量测定
3d(3)
28(3)
14(3)
7d(3)

1)
鼠龄6周的健康雄性大鼠60只,体重200—250 g,随机分为对照组、模型组、大豆异黄酮低、中、高浓度组,每组12只。

2)
将大鼠乙醚全身麻醉后仰卧位固定于大鼠实验台上,将舌拉出,用压舌板压舌腹,在额镜直视下,趁动物吸气瞬间迅速将连于1 ml 注射器的平端9 号针插入气管约45 cm ,以博来霉素(5mg/kg体重)的生理盐水0.2~0.3ml注入气管,旋转动物,使药液在肺内分布均匀,复制建立模型组和大豆异黄酮组大鼠的肺纤维化模型,并注射等量生理盐水建立对照组。

3)
从第2天起到第28天止,大豆异黄酮低、中、高组大鼠分别给予大豆异黄酮(临用时溶于0.5%羧甲基纤维素钠(CMC~Na)溶剂中)浓度为30、60、120mg/(kg·d)灌胃,对照组和模型组大鼠则以等量0.5%CMC~Na灌胃。

4)
以上动物分别在注射BLM 后3d 、7d、14d、28d处死(每次每组随机抽取3只)。

2.3 实验观察

1)
病理标本取材及处理异丙巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射,麻醉后开胸,结扎左支气管,取左肺用双蒸馏水1:5研磨成组织匀浆,3 000 r·rain 10 rain离心后用于组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、羟脯氨酸测定自气管向右肺注射体积分数为0.1福尔马林液,内固定1wk,常规石蜡切片( 5μm) 染色。

2)
肺组织形态定量观察平均肺泡间隔宽度(μm) :用尺型显微测微器测定肺泡间隔宽度,每张切片测3 个视野,取平均值。单位面积上纤维化灶所占的分面积,HE ×100 倍下每张切片观察10 个视野,ASM 68K 图像分析仪上测得单位面积上纤维化灶所占的分面积

3)
肺组织MDA、SOD、羟脯氨酸的测定:肺组织匀浆MDA、SOD、羟脯氨酸的测定按试剂盒说明书操作步骤进行。

4)
统计方法:应用SPSSI3.0统计软件进行统计学处理,数据用均数土标准差( ±s)表示,样本均数的比较采用单因素方差分析和检验,以a=0.05为检验水准,如果P<0.05,则认为差异有统计学意义。

附表:

肺组织SOD、MDA、Hyp含量比较( 士 s,n=3)

组别
SOD
(nmol/L)
MDA (nmol/L)
Hyp (nmol/L)


3d
7d
14d
28d
3d
7d
14d
28d
3d
7d
14d
28d

对照组

模型组

SI-L

SI-M

SI-H


预期结果与讨论

1)
本实验对照组3d 、7d、14d、28d大鼠肺结构清晰,各观察点均未出现明显改变。模型组3d 、7d、14d、28d肺结构逐渐不清楚,炎性细胞浸润,血管内皮损伤,肺泡间隔渐增宽。大豆异黄酮组呈大豆异黄酮浓度依赖性肺结构完整,肺纤维化病理变化较模型组明显减轻。模型组与对照组比较显示肺纤维化模型建立成功,大豆异黄酮组与模型组比较说明大豆异黄酮对肺纤维化有保护修复作用。

2)
大豆异黄酮组与模型组比较:大豆异黄酮组动物肺组织SOD活性显著升高且有随浓度呈升高趋势,显示大豆异黄酮可能是通过激活SOD,抑制和清除自由基,改善氧化与抗氧化平衡减轻肺组织细胞膜的损伤减少炎症细胞的渗出,削弱炎症反应等机制对肺纤维化的发生发展起到一定缓解作用;大豆异黄酮组动物肺组织MDA含量呈浓度依赖性显著下降,说明大豆异黄酮可抑制或减轻脂质过氧化作用,使脂质过氧化物生成减少,从而保护组织细胞免受损伤;大豆异黄酮组羟脯氨酸含量显著低于模型组,说明大豆异黄酮对肺间质纤维化病变有一定防治作用,可能机制是通过减少胶原合成或促进胶原降解而发挥作用。

【参考文献】

1)
朱愉,多秀瀛.实验动物的疾病模型 天津:天津科技翻译出版公司,1997:24-6

2)

Yan XH
.Gu JF, Sun CP,et.
effct and mechanism of antioxidant of soybeanisoflavone. 2000;l8(1):l4

3)
刘建国,吴赛珠,隗和明等.[J].中华医学杂志,雌激素有一定的保护肺血管内皮功能 2001,81:852~55.

4)
金威弦 张珍祥 王迪深 实用呼吸之流行病理生理学 湖北华中科技大学出版社 2007;210-211

5)
毛峻琴,宓鹤鸣.大豆异黄酮的研究进展
[J].中草药,2000311):6164

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发表于 2011-9-11 13:23:44 | 显示全部楼层
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发表于 2011-11-7 12:58:15 | 显示全部楼层
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